从目标转录本创建设计(向导)

您可以使用此向导来通过由GE探针设计创建的探针来设计微阵列。“GE探针设计”根据目标序列数据来创建表达谱类型的探针。如要指定此目标序列数据，您需要上传一个目标序列的FASTA格式文件，或者一个GenBank参照号的TDT文件。

“GE向导”引领您完成六个步骤。如要查看本帮助主题的各个部分，点击以下的链接：

在您使用向导之前

开始向导

步骤1 – 选择方法

步骤2 – 选择参数

步骤3 – GE探针格式目标序列和上传

步骤4 – 定义设计

步骤5 – 布局探针

步骤6 – 创建微阵列设计

 

在您使用向导之前

 

To start the wizard

  1. 点击工作区标签，或进入一个合作。

  2. 设置应用类型为表达谱。

  3. 点击主页。

    工作区或合作主页将出现。

  4. 在设计向导处，选择从目标转录本来创建设计。

  5. 点击下一步 >>。

    向导将在一个新窗口中打开。

 

步骤1 – 选择方法

在此步骤中，您指定一个基本方法，eArray用此方法来从您的目标序列创建探针。

  1. 选择以下探针设计方法之一：

方法

描述

碱基组成优先法

创建长度全部相同的探针，基于一个经验决定的的最佳基本组成配置。此方法为标准GE探针设计方法。它与安捷伦协议和大多数真核有机体配合得最好。

解链温度(Tm)匹配法

创建的探针全部具有相近的预测解链温度(Tm)。对于原核生物，此方法是一个很好的选择。

  1. 点击下一步 >>。

    向导的下一步将出现。

 

步骤 2 – 选择参数

在此步骤您指定eArray生成的探针的详细信息。

  1. 在探针详细信息框中设置以下参数。其中一些参数仅适用于解链温度(Tm)匹配法。

参数

说明/详细信息

设计任务名称

输入一个名称，这样您过后可以以此辨识出此具体的GE探针设计任务。

探针长度

输入生成探针的最大长度。最大允许长度为25到60个碱基对。

安捷伦发现，对于安捷伦原位微阵列平台上的大多数实验，一个长度为60个碱基对的探针能够提供敏感度和专一性之间的最优平衡。

每目标序列探针数

为每个目标序列选择从1到10个探针。这是探针设计过程为每个上传的目标序列返回的最大探针数量。如果该目标序列质量较差(例如，如果它们包含重复序列和/或载体序列)，那么探针设计过程就可以返回少于您所指定数目的探针。

因为生成探针的长度和高质量，安捷伦建议，您每个序列只创建一个探针。然而，如果每个目标序列创建了多个探针，您可以在一个验证过程后从中选择最好的探针。

屏蔽

eArray总是在探针设计过程中两个选项都使用，且它们不能被禁用。

载体序列 – 在探针设计过程中识别和忽略杂质片段。目标序列可能包含不是从研究样本中得来的杂质片段。这些片段通常都是来自克隆和放大过程中使用的克隆载体(例如，质粒、噬菌体、BAC、YAC)。

重复序列 – 在探针设计过程中识别和忽略目标序列中的重复序列。任何一个生物的基因组都包含零散分布的重复序列和低复杂度DNA序列。这些重复序列对于特定物种来说是独特的，它们在整个基因组中重复很多次，因此也存在于转录组中。重复序列区域不适合用来设计特异性强的探针。

探针取向

选择以下选项之一：

有意义链 – 取向于有意义链或"编码链"的探针，它们的序列和目标信使RNA(mRNA)序列相同。当样品制备方法产生cDNA或cRNA分子时，请选择此选项。

反义链 – 取向于反义链或"模板链"的探针，它们的序列是和目标信使RNA(mRNA)序列反向互补的。如果您在利用由RNA直接标记产生的样本时，请选择此选项。

设计选项

请选择您偏好的设计过程。这些选项只有当您在每个目标序列上设计多个探针时才有意义。

最优探针法 – 相比于让探针在探针选择窗口中均匀分布，探针设计过程更偏好选择最优可用探针。

最优分布法 – 相比于选择最优质量的探针，探针设计过程更偏好让探针在探针选择窗口中均匀分布。

偏置3'端设计

如果您想要让生成的探针集中于每个目标序列3'端的1,000个碱基对，请选中此选项。

如果您使用安捷伦(或其他公司)的线性放大标记方式，在目标序列3'端选择探针是十分重要的。由于聚合酶反应活性的衰减，线性放大通常产生比起始模板要短的序列。因为这样的原因，大多数标记产物只能代表每个目标序列3'端大约1000个碱基对。所以在这个区间设计探针是非常必要的。

允许探针被剪切

(仅可用于解链温度匹配的GE探针设计任务) 如果选中此复选框，则允许探针被剪切至短于“探针长度”处的长度。此操作可以使解链温度(Tm)接近目标解链温度(Tm)。探针不会被被剪切到少于45个碱基对。

从概念上说，一个探针越短，它的可用互补序列就更少，这就降低了它的专一性，或者破坏了了它与目标序列形成一个稳定的双螺旋的能力。然而，这种情况十分严重的风险却很低。

最优探针解链温度

(仅可用于解链温度匹配的GE探针设计任务) 输入探针设计过程的目标解链温度(Tm)。

在此温度下，DNA的两条互补链中，双链形式和单链形式以50:50的混合。

基于两个因素来选择探针的解链温度的：

  • 目标转录组能够生成的全部探针的解链温度的均值和标准差。

  • 杂交流程中认定的杂交温度。

实际操作中，目标解链温度应该比杂交温度高20° C左右。例如，如果杂交温度为60°C，那么目标探针解链温度就为80°C。

  1. 点击下一步 >>。

    向导的下一步将出现。

 

Step 3 – GE探针格式目标序列和上传

在此步骤，您选择目标序列和转录组文件(可选)来上传，并提交一个GE探针设计任务。文件名称不应包含空格。

  1. 在目标序列文件详细信息处，指定以下信息：

以FASTA格式上传 – 点击浏览。选择想要的FASTA格式目标序列文件，然后点击打开。您的文件的名称将出现在框中。eArray要求文件应为压缩格式(*.zip格式)。

上传GenBank参照号 – 点击浏览。选择想要的 GenBank参照号文件，然后点击打开。您的文件的名称将出现在框中。eArray在开始“GE探针设计”过程之前，先将文件中的GenBank参照号分解为实际的序列。eArray要求文件应为压缩格式(*.zip格式)。

  1. 在转录组详细信息下，选择您想要探针设计过程使用的转录组数据类型。探针设计过程应用转录组数据作为一个相似度数据库，从而消除那些有可能和非目标序列产生高度杂交反应的探针序列。

  2. 点击下一步 >>。

    一个消息会通知您，您已经将您的设计任务提交至eArray，任务完成后，您将收到一封电子邮件。

  3. 点击关闭。

eArray会暂停向导。在工作区或合作区的首页，该任务会显示在“设计向导”框的“查找结果”区域中，状态为“GE设计提交”。点击刷新来更新框中的信息。

当任务完成后，您将收到安捷伦的电子邮件，该任务的状态也会变为“探针已被上传”，并且“操作”栏中会出现一条“继续”链接。

 

步骤4 – 定义设计

当您的探针设计任务完成后，您可以返回到向导中来。在此步骤中，您定义微阵列设计或设计集的基本特征点，例如名称、格式、以及位置。此外，如果您想要添加连接器来“抬高”探针的活跃杂交序列使之远离玻璃微阵列基底，来减少位阻现象，您也在此步骤中设置。

  1. 设置应用类型至Expression，如需要。

  1. 在恰当的工作区主页，在“设计向导”框的“查找结果”部分，在您想要进行的向导旁边，点击继续。如果想要的向导不可见，您可能需要点击查看全部来查看完整列表。

    向导将在一个新窗口中打开。它会显示您已经进行到步骤4 — 定义设计。

  1. 指定以下参数。除非另作说明，全部都为必填。

参数

说明/详细信息

定义设计

微阵列名称

为微阵列设计输入一个名称。eArray使用此名称作为微阵列设计的一个查找条件，也是在查找结果、列表、以及类似地方用来指代此设计的方式。

设计格式

从列表中选择一个设计格式。要查看选中的设计格式的详细信息，请点击显示详细信息。

当您选择一个设计格式时，一个合适于设计格式和应用类型(以及，对于CGH和ChIP应用类型来说，还有物种这一项)的内置质控探针组将出现在“内置质控探针组”处。

仅那些可用于您选择的应用类型的设计格式会出现在列表中。一些应用类型仅支持一种设计格式。

内置质控探针组

所需的安捷伦内置质控探针组的名称将显示为一个链接。点击该链接来查看它的详细信息。eArray会自动选择一个合适于您的设计格式、应用类型、和物种(在某些应用类型下)的内置质控探针组。

如果 plus_minus_icon.gif 出现，您就可以选择一个替换的内置质控探针组。

如要选择一个替换的内置质控探针组：

  1. 在内置质控探针组处，点击 plus_minus_icon.gif。
    一个可用的内置质控探针组的列表将出现在一个新的窗口中。

  2. 选择想要的内置质控探针组，然后点击完成。

文件夹

为您新的设计选择一个位置。那些您拥有访问权限的文件夹将出现在列表中。

描述

(选填) 为该设计输入一个简要的描述。

物种

(只读) 您在向导的步骤1设置的物种将出现在这里，仅作告知用。您不能编辑它。

关键词

(选填) 输入新的查找关键词来与该设计关联，用逗号分隔。指定关键词可以帮助您稍后来查找此微阵列设计。

附件

(选填) 附件就是与您的微阵列设计相关的文件或链接。附件文件最大可以有32 MB。如要添加一个或多个附件，请参照以下步骤：

  1. 点击 plus_minus_icon.gif。
    一个页面将在一个新窗口中出现。

  2. 在“添加附件”框中，指定以下信息：

名称 – 为附件输入一个名称。此名称将成为您访问附件而用来点击的链接。

类型 – 从列表中选择想要添加的附件的类型。一个附件可以使一个文件或是一个URL。

位置 – 从列表中选择恰当的位置。eArray使用此选项来选择已在您的区域中定位的内容，如果该内容可用的话。

文件 – (仅当您选择附件类型为“文件”时) 点击浏览... 在出现的对话框中选择想要添加的附件，然后点击打开。

URL – (仅当您选择附件类型为“URL”时) 输入因特网资源的位置URL，包括协议说明符。例如，http://www.agilent.com。

  1. 点击添加。
    附件将出现在窗口顶部的“附件标题列表”中。会显示一个成功消息。

  2. 点击关闭。

  3. 如需要，可添加更多附件。
    如果您添加的一个附件出错，在“附件标题列表”中选中它名称旁边的复选框，然后点击移除。

  4. 点击完成。
    窗口将关闭。您的附件的名称作为链接出现在“附件”处。.

备注

(选填) 输入一段备注来包含在微阵列设计中。

连接器详细信息

添加连接器到3'端

选中此复选框来添加连接序列到您的探针。

连接器是一些核酸分子，用来被合成到探针序列的3'端。它们只是使活跃探针序列更加远离微阵列表面，这样可以减少位阻现象。这就可以让活跃探针序列可以更多的被用于杂交中。连接器使用随机序列，或从自然界中没有的序列来衍生出连接器。安捷伦提供一个默认的连接器序列供您使用，但您也可以指定您自己的自定义连接器序列。

如果您选择了此选项，请同时设置连接器长度和连接器序列

连接器长度

选择以下选项之一：

  • 固定探针长度 – 添加核苷酸到探针的3'端，这样探针就可以具有指定的长度。在此框中，输入一个20到60之间的核苷酸数目。如果您的微阵列设计包含长于您指定的长度的探针，eArray将不对其进行处理。它们即不被剪切，也不回被添加连接器。

  • 固定连接序列长度 – 添加指定数目的核苷酸到探针的3'端。在此框中，输入一个1到49的核苷酸数目。如需要，eArray将截短探针上的连接器，以防止探针总长度超过60个核苷酸。如果连接器序列短于您指定的长度，eArray将重复连接器序列来达到该长度。

连接器序列

选择以下选项之一：

  • 应用安捷伦连接器序列 – 您无法编辑安捷伦提供的连接器的序列。

  • 应用客户连接器序列 – 为该连接器输入一个DNA碱基序列。

  • 注意：eArray会添加安捷伦连接器序列到安捷伦探针，即使您选择了应用客户连接器序列。

  1. 点击下一步 >>。

    向导的下一步，布局探针，将出现。
     

步骤5 — 布局探针

在此步骤中，您可以添加探针组到您的微阵列设计/设计集。

  1. 在选择探针和布局选项下，按下表中的描述来指定您想要包含进您的微阵列设计/设计集的探针。您可能需要下拉页面来查看一些选项。

    任务

    说明/详细信息

    选择探针和布局选项

    添加或移除一个biological或用户内置质控探针组

    您可以从您的微阵列设计添加或移除一个biological或用户内置质控探针组。

    添加一个biological或用户内置质控探针组

    1. 在“探针组详细信息”标签下，点击Biological <type> 探针组详细信息, 然后点击添加。
      一个探针组选择页面会在一个新窗口中出现。

    2. 按选择您的探针进行探针查找的描述来选择一个或多个探针组。
      如要添加更多探针组，请再次点击添加。

    3. 在对照类型栏，为每个探针组选择想要的对照类型。请参阅下面的更改探针组对照类型。

    移除一个biological或用户内置质控探针组

    1. 在“探针组详细信息”标签下，点击Biological CGH 探针组详细信息，然后选中您想要移除的探针组旁边的复选框。

    2. 点击移除。

    3. 注意：
      • 不同的主题分别描述了怎样添加或移除归一化或重复探针组。
      • 一个CGH+SNP微阵列必须至少包含2000个探针，且至少5%的总特征点必须被CGH探针填充。

    添加或移除一个归一化探针组

    (仅CGH微阵列) 一个归一化探针组就是一个特殊的对照探针组，它提供的数据可以用来归一化eArray生成的两种荧光颜色数据。当您创建一个特定物种和设计格式的微阵列时，eArray自动的添加一个默认的安捷伦归一化探针组。如果归一化探针组出现在您的设计中，您可以下载一个唯一探针的列表，用来使用在“安捷伦特征点提取(FE)”程序中。此文件的名称为Agilent dye normalization probe list for FE。

    如要添加一个归一化探针组

    1. 在归一化探针组详细信息下，点击添加。
      一个探针组选择页面将出现。

    2. 按选择探针组进行探针查找中的描述，选择一个或多个探针组。
      选中的探针组将出现在探针组名称处。

    3. 注意：当您添加一个归一化探针组到一个微阵列设计集时，eArray会在设计集内的每一个微阵列上放置一个此探针组的复本。

    如要移除一个归一化探针组

    1. 在归一化探针组详细信息下，选中您想要移除的探针组旁边的复选框。

    2. 点击移除。

    添加或移除一个重复探针组

    (仅CGH和表达谱微阵列) 一个重复探针组就是一个特殊的对照探针组，Feature Extraction和DNA Analytics可使用此探针组来计算重复性(Reproducibility QC Metric)。这些重复探针组不同于那些用户选择的探针组，尽管用户可以选择在一个微阵列中包含某一探针组的多个复本。

    对每种荧光颜色，此度量标准是这些重复探针在去处异常值后，再去除背景的信号强度% CV的中位数。当您创建一个特定物种和设计格式的微阵列时，eArray自动的添加一个默认的安捷伦重复探针组。

    如要添加一个重复探针组

    1. 在重复探针组详细信息下，点击添加。
      一个探针组选择页面将出现。

    2. 按选择探针组进行探针查找中的描述，选择一个或多个探针组。
      选中的探针组将出现在探针组名称处。

    3. 在重复处，输入将要包含在设计中的探针组的复本个数。安捷伦建议值为5。

    4. 注意：当您条件一个重复探针组到一个微阵列设计集时，eArray会在设计集内的每一个微阵列上放置您指定的个数的此探针组的复本。

    如要移除一个重复探针组

    1. 在重复探针组详细信息下，选中您想要移除的探针组旁边的复选框。

    2. 点击移除。

    查看一个探针组

    • 在任何可用的探针组名称栏中，点击您想要查看的探针组的名称。.

      “查看探针组”页面将在一个新窗口中打开。关于此页面的详细信息，请参阅查看探针组。

    更改探针组的对照类型

    (当可用时) 在探针组详细信息下，在恰当的探针组旁边的对照类型栏中，选择一个选项。阳性或阴性用户对照探针组必须在您的设计/设计集上共同占用50%或更少的特征点。  

    • pos – 选择此选项来指定此探针组为一个阳性用户对照探针组。尽管Feature Extraction软件中的很多统计QC指标不包含阳性对照探针组，阳性对照仍可用于下游分析。通常上说，阳性对照探针组显示显示可预知的信号强度，但这也不是必需的。安捷伦内置质控探针组中的一个阳性对照探针组的例子是安捷伦spike-in 对照探针，它在基因表达谱应用类型中被用于计算QC标准。

    • neg –  选择此选项来指定此探针组为一个阴性用户对照探针组。 阴性对照探针组不会产生杂交。自动分配的内置质控探针组都会有足够的阴性对照探针组。如果您有额外的阴性对照探针组，这些阴性对照是被Feature Extraction用于背景信号测定(不管它们是否只有背景信号)。

    • biological – Designates that the probe group is not a control (condition = FALSE). It is the default choice for biological probes, which should comprise at least 50% of your design.

    • ignore – 在Feature Extraction软件的分析和输出中忽略该探针组。一旦一个微阵列被提交，对照类型就不能被更改了，所以，唯一可以恢复对照类型的方法就是修改设计文件中的对照类型。

    • 注意： 

      • 在一个微阵列集中，如果您将一个探针组的对照类型更改为neg或pos，您必须同时也选择一个探针分布选项。

      • 对于SureSelect Capture微阵列和microRNA应用类型，所有探针组的对照类型都应为biological。

    更改探针组的复本数量

    (可用于用户非对照探针组。对于CGH和表达谱设计，还可用于重复探针组。) 在探针组详细信息的重复栏中，在想要的探针组旁边，输入您想要包含在微阵列设计中的该探针组的复本数量。

    • 注意：对于microRNA应用类型，重复参数永远被设为1。

    允许eArray创建一个微阵列设计集

    在探针组详细信息下，选中启用微阵列设计集。

    如果您选择了此选项，且需要用来承载您的微阵列设计的特征点数目超过了一个微阵列载片上的可用特征点数，eArray就会按需要添加额外的载片。

    “创建微阵列设计”框的第三栏中的“填充百分比”数据帮助您监测您的微阵列有多满。如果填充的百分比超过了100%，您必须选中“启用微阵列设计集”才能承载您的设计中的所有探针，或者选择一个具有更多特征点位置的设计格式。

    对于一个微阵列集中的阳性或阴性用户对照探针组，您必须同时选择一个探针分布选项。

    当您创建一个微阵列设计集时，您可以均匀分布(当可用时) 一个阳性或阴性对照探针组作为微阵列创建过程的一部分。如果您选择了此选项，eArray将探针组中的探针均匀的、随机的平铺到全部用来支持内容的微阵列上。

    如果您不选择“均匀分部”，eArray一次应用一个探针组到微阵列上，直到全部探针组都被分配了。它将来自一个探针组的全部探针置于一个微阵列上，并可能导致每个微阵列上的探针数目不同。

    • 注意：
      • 一旦您创建了一个单独微阵列设计，您将不能将它转换为一个微阵列设计集，即使您向其中添加了额外的探针并超过了设计格式的容量。相似的，一旦您创建了一个微阵列设计集，您也不能将它转换为单独的微阵列设计。

      • “均匀分部”选项不可用于microRNA或SureSelect Capture微阵列应用类型的微阵列。.

      • 您不能创建一个CGH+SNP微阵列集。

    更改一个微阵列集中的阳性和阴性对照探针组的分布

    (可用于含有对照类型为pos或neg探针的微阵列集) eArray总是将每个阳性和阴性对照探针组的复本置于微阵列集中的每个微阵列上。在每个微阵列上，对照探针组中的探针总是随机的分配到特征点上去。然而，您也可以在一定程度上控制探针怎样分配到这些随机选择的特征点。

    在探针组详细信息处，在对照探针位置栏中，为每个阳性或阴性用户对照探针组选择以下选项之一：

    • 可变随机 – 每个阳性或阴性对照探针在微阵列集合中的每个微阵列上的位置都不一样。例如：eArray在一个微阵列上将探针A随机分配到特征点位置4330。在该集合的另一个微阵列上，探针A可能就会分配到特征点位置961。

    • 固定随机 – 一个给定的阳性或阴性对照探针在微阵列集合中的每个微阵列上的位置都一样。例如：eArray在一个微阵列上将探针A随机分配到特征点位置4330。在该集合的另一个微阵列上，探针A也会被分配到特征点位置4330。

    • 注意：对于其他类型的探针组，eArray总会以特定的方式安排它们的特征点位置：

      • 对照类型为biological或ignore的探针组 – 对于每个重复请求，eArray都会将探针组的一个单个复本随机的置于集合中的每一个微阵列上。

      • 重复探针组详细信息框或归一化探针组详细信息框中的探针 – 当这些类型探针被包含进一个微阵列集中时，eArray会应用“可变随机”方式来将每个探针的一个复本置于每个微阵列上。

      • 安捷伦内置质控探针组 – 对于除SureSelect Capture微阵列应用类型外的其他应用类型，集合中的每个微阵列都会含有这些探针的一个集合。这些探针在每个微阵列上的放置方式都相同，具体方式在内置质控探针组规格说明中被定义。

    填充未使用的特征点

    您可以使用您选择的探针组来填充微阵列上未使用的特征点。eArray可能仅添加该探针组的一部分，或一些探针组或全部探针组的多个复本，取决于您的设计上的可用空特征点数，以及探针组中的探针数量。如要添加一个完整探针组到您的设计，请使用在上面的添加探针组中描述的方法。

    参照以下步骤来填充未使用的特征点：

    1. 选中填充微阵列。

    2. 在填充微阵列的探针组处，点击 plus_minus_icon.gif。
      一个探针组选择页面会出现在一个新窗口中。关于怎样使用此页面的说明，请参阅选择探针组进行探针查找。

    安捷伦对于未被使用的CGH微阵列特征点的指导

  1. 注意：当您使用一个“设计向导”来创建一个微阵列设计时，仅有随机特征点布局是可用的。如要使用用户指定的探针顺序来创建一个设计，您必须使用另外一种方法来创建设计。

  1. 点击下一步 >>。

    向导的下一步会出现。
     

步骤6 — 创建微阵列设计

在此步骤中，您将您的设计保存为一个具体的状态。

  1. 在您希望怎样保存和创建您的设计？处，选择以下选项之一：

  2. 点击保存。

    eArray将创建并保存你的设计。会出现一个成功的消息。

  3. 点击关闭。

    会出现另外一个成功的消息。

  4. 点击关闭。

相关链接

关于表达谱(GE)探针设计

通过向导来创建一个微阵列设计/设计集

自定义微阵列设计向导