常见问题(FAQ)

目前，安捷伦建议您一次上传不超过200,000个探针。。您上传探针越多，它们出现在您账户中就越慢。如果有其他用户在您之前提交探针上传，您可能需要等待更长时间才能开始您自己的上传。

安捷伦的内置质控探针组包含三种类型的对照探针：1)安捷伦的内置质控探针组包含三种对照类型：1) 取决于所选的应用类型，阳性探针通常可以产生可预计的信号强度。阳性对照探针包括spike in (e1A)对照和内生目标序列(housekeeping) 对照探针； 2) 阴性对照探针是设计用来在杂交之后不产生信号，从而可以用于背景去除算法的一部分；以及3) 生产对照探针是安捷伦用于控制微阵列质量、以及在微阵列未达到预期表现时用来寻找错误原因。

每个微阵列上的可用探针数取决于应用类型、微阵列格式、和目标物种。若要确定一个微阵列上的可用探针数，您可以使用微阵列计算器。

不可以，所有的array都需要有内置质控探针组。具体的内置质控探针组取决于应用类型、微阵列格式，当应用类型为CGH或ChIP时，还取决于目标物种。

当您提交注册申请时，您仅完成注册过程的第一步。您的账户还需要被批准和启用。请参阅如何注册。

取决于系统中用户的数量，以及您提交探针的数量，上传探针至您的工作区可能花费数日。在个别时候，您上传的探针设计集会产生一个上传错误。如果您所在机构的IT部门过滤含有.zip文件的邮件，您可能无法收到错误报告，因此会引起您过长时间的等待上传过程的完成。

安捷伦不建议创建非随机微阵列。但是，为了履行安捷伦的承诺“print what you want”，您可以在array创建的过程中进行此项工作，在探针布局步骤。您首先下载包含所有需要放置在微阵列上的探针的源文件。在您将探针按照您想要的顺序放置后，您将此文件上传至eArray。这就将创建一个有序的布局。请参阅提供特征点顺序。

是的。您可以针对具体的基因组片段来查找CGH高密度数据库中的探针。此功能允许您返回指定片段上的全部探针、或者一个指定探针密度的探针。请参阅怎样进行高密度(HD)查找。

不能。如果您下载目录探针后又将其重新上传，系统会将它们识别为您账户中的新探针。如果您通过离线工具创建了一个目录探针的子设计集，请在eArray中使用查找您的探针(高级查找)功能来选择该子设计集。此功能允许您通过探针ID来查找探针，并将返回的探针保存为一个探针组。

除了探针ID和序列外，目标序列ID、多个登录号、基因符号、一个描述行、以及一个染色体位置都可以被分配给探针，使用完整探针上传文件格式。请参阅探针的文件格式和上传要求。

在eArray中指定物种有两个原因：1)这可以多提供一个变量用来查找探针，2)对于CGH和ChIP应用类型，每个微阵列所需的内置质控探针组都是物种特异的。

如果您想要的物种不可用，请在下拉式菜单中选择NA作为物种类型。如要将您的物种添加到物种数据库中去，请通过技术支持人员提交一个申请。如果您准备选择此操作，请不要上传您的探针并选择NA。

连接器可以将探针移动远离玻璃微阵列基板，从而减轻位阻现象。在eArray中，您可以将连接器应用到长度小于60个核苷酸的探针，以来增加该探针有效序列的生物效用。

例如，如果您有长度为25mer的探针，您可以通过添加一个连接器而将它们补齐为40mers，从而增加25mer的有效序列在杂交反应中的可用性。eArray将连接器加载在探针的3'端。连接器序列通常从一个在生物界不存在的序列衍生出来，或者是随机选择的。安捷伦为您提供一个您可以选择使用的默认连接 序列。

不。eArray在探针设计过程中不接受 phred scores。

我们现在还不能提供这样的数据。然而，许多客户都曾经成功的应用安捷伦计算生成探针来解决特定的生物问题。

安捷伦在eArray中每3-4个月就更新一次探针注释。

大多数eArray功能也支持Firefox。

安捷伦定制CGH微阵列的内容是由它包含的探针组而决定的。一个自定义微阵列是通过创建和结合探针组而设计的。一个探针组包含两个或多个探针。探针组可以在一个微阵列设计中被混合和匹配。

分离区域到不同的探针组中，可能是一个有效的方法（比如，设计不同的区域来针对不同疾病或探针密度），并在将来的微阵列设计中考虑可能的混合搭配调整。 如果您有一组探针想以后被复制或被用作归一化探针组，那么它们就需要处于一个单独的探针组中。 探针组可以通过三种不同的方法来创建：

• （强烈推荐）通过搜索安捷伦的HD -CGH数据库，该数据库为一个预先设计好的高密度探针数据库

• 通过上传自己的探针

• 通过搜索您自己的探针或探针组

• 通过基因组铺瓦式设计，也就是，以一个精确的间距设计探针

这需要通过不同的，迭代的搜索工作来完成。 对于每个搜索，都有一个探针组被创建，然后通过结合不同的探针组来设计微阵列。 一旦所有的探针组都被创建，在“微阵列”标签下就会有一个微阵列计算器，来帮助计算对于所给定数量的探针来说，哪种阵列格式比较合理。在“探针组”标签下也会有一些工具来对探针组进行比较并消除不同的探针组中重复探针。

最低的探针数目取决于畸变区的大小、做出畸变判断所需的探针数（例如：1，2，3或以上）和实验的整体噪音。DLRSD（derivative log ratio spread, probe-to-probe log ratio noise）质量控制标准是一个对于安捷伦aCGH实验的整体噪音的比较好的估计，这和DNA的质量密切相关。 至于最大探针数，在某一区域放置更多探针并不一定帮助确认小范围的畸变（请参见Ylstra 等人所著的（Nucleic Acids Research, 2006, Vol. 34, No. 2 for a discussion on functional resolution of CGH experiments）。首先，如果创建一个密度极高的设计，它必然包含一些分数较低的探针。安捷伦HD-CGH数据库中的所有探针都有一个预期的表现评分（基于解链温度，GC含量，一个发夹deltaG，序列复杂性，以及衡量与参照基因组的其余部分的相似度的标准）。eArray的成对还原算法（pair-wise reduction algorithm）将基于用户选择的平均高密度探针间距、或者高密度探针总数来选择最佳的探针。在一个密度极高的设计的情况下，成对还原算法将不再能够返回最好的探针，而将返回所有或大部份可用探针。请查看常见问题“什么是CGH探针评分？”来获取更多信息。

此外，密度极高的设计有可能使杂交产生不良的结果。安捷伦标准DNA标记流程，产生大约200nt的DNA判断。在一个密度极高的设计情况下，阵列上的探针将相互竞争相同的杂交片段。 在一小片区域放置过多探针将降低的信号的强度，可能产生有噪声的数据。安捷伦不建议使用低于150 - 200bp的探针间距。

下图的示例是使用高密度查找或基因组叠瓦式设计而获取的不同密度探针的CGH数据。间距为200bp的高密度查找获得的探针，产生的对数比非常接近于预期值-1

使用“基因组叠瓦式设计”而产生的探针，全面的来看，表现会劣于安捷伦HD-CGH数据库中的探针。 安捷伦非常强烈的建议您使用安捷伦的HD -CGH探针数据库，而不是“基因组叠瓦式设计”选项。仅对于那些数据库中没有足够的高密度探针可用的区域，可以考虑“基因组叠瓦式设计”。

数据库中的所有高密度探针（除了没有最优解链温度optimal-Tm探针可用的区域），都已经进行了解链温度匹配，并有预期的表现评分（基于解链温度，GC含量，一个发夹deltaG，序列复杂性，以及衡量与参照基因组的其余部分的相似度的标准）。eArray的成对还原算法（pair-wise reduction algorithm）将基于用户选择的平均高密度（HD）探针间距每间隔或高密度（HD）探针总数来选择最佳的高清探针。此外，高密度探针可以通过解链温度筛选器、相似度筛选器（非独特探针筛选器，完全匹配筛选器，相似度评分筛选器）来进行筛选，或者，目录探针可以被优先选择。 相反，在“基因组叠瓦式设计”中，探针被随机选择，基于探针间隔而不是性能。 唯一能够提高性能的选项，只是探针修剪和跳过重复区域。

下图表示安捷伦的HD-CGH探针的CGH数据和“基因组叠瓦式设计”探针的CGH数据。相比于“基因组叠瓦式设计”探针，HD-CGH探针的中位log2比率曲线 更贴近预期值-1，并在与“基因组叠瓦式设计”探针比较时具有偏差较小。

安捷伦的HD-CGH探针数据库中的每一个探针都有一个表现评分，数值介于0和1之间。得分越高，就表示一个探针越有可能在一个安捷伦的CGH微阵列上产生一个良好的指数比率。由eArray产生的评分是基于一种统计模型，对应在一个模型系统中的探针指数比率，来回归计算由计算机模拟的探针参数。使用的参数包括解链温度、GC含量、一个发夹deltaG ，序列复杂性，以及衡量与参照基因组的其余部分的相似度的标准。 该探针评分是对特定探针指数比的预测。响应是指观察和预测的比率。 高密度数据库中的所有探针的平均得分 是0.759，安捷伦目录阵列探针AMADID 021529 (SurePrint G3 Human CGH Microarray 1x1 M)的平均得分是0.917。

您可以从eArray获得定制探针的分数（如通过“基因组叠瓦”设计的探针）。如要进行此操作，请提交探针评分任务（在“探针”下，“评分自定义探针”下）。在自定义评分时，上述所有数据都会进行计算并被插入到模型中来生成探针得分。一旦探针评分任务完成，CGH探针评分就可以在探针评分任务中被下载，或者通过下载探针组中的tdt文件。得分低探针可以筛选到eArray之外，通过下载特定评分的探针组并且可以设定一个评分门限，得到一组得分超过门限的探针列表。 在DNA Analytics软件（Genomic Workbench 6.0 或更高版本的组成部分）中，探针可以通过探针得分来进行筛选。

下图表示安捷伦的HD-CGH探针的探针评分和“基因组叠瓦式设计”探针的探针评分。如同预计的一样，基因组叠瓦式设计返回的探针评分十分相似。这是因为基因组叠瓦式设计在选择探针序列时不考虑探针评分。另一方面，高密度（HD）查找应用算法，在根据表现评分选择高分探针时，均匀的选择指定密度的探针。

• 对于使用安捷伦的HD - CGH探针数据库选择的探针：

数据库中所有避免重复区域高密度探针都是解链温度匹配的（除了在某些区域内没有最佳解链温度探针存在），并有预期的表现评分（基于解链温度，GC含量，一个发夹deltaG，序列复杂性，以及衡量与参照基因组的其余部分的相似度的标准）。 eArray的成对还原算法（pair-wise reduction algorithm）将基于用户选择的平均高密度（HD）探针间距每间隔或高密度（HD）探针总数来选择最佳的高清探针。此外，高密度探针可以通过解链温度筛选器、相似度筛选器（非独特探针筛选器，完全匹配筛选器，相似度评分筛选器）来进行筛选，或者，目录探针可以被优先选择。

• 对于使用基因组叠瓦式设计来选择的探针：

GC丰富，高解链温度，以及重复区域的探针是个大问题。在基因组叠瓦式设计中能够提升探针表现的唯一选择，是探针修剪和跳过重复区域。新的探针集合可以进一步改善，通过筛选出高解链温度或GC丰富的探针。解链温度和GC％可从eArray下通过“探针”标签下的“评分自定义探针”功能来实现。然后可以通过搜索筛选出的探针ID，来创建一个新的探针组。

当选中“无筛选器”时，任何探针都可能被选择，无论与其他的基因组位点有多大的相似度。请记住，“非唯一”探针的数据将更加难以解释，使用“非唯一探针筛选器”选项来限制最大完美基因组击中数就会很有帮助。

当选中“完美匹配筛选器”时（或在“非唯一探针筛选器”完美的基因组命中的最大数量设置为1），含有一个以上的完美匹配基因的探针被排除在外，并将因此无法在Segmental Duplication或Pseudo-Autosomal Regions (PAR)中找到复制探针。“相似度评分”筛选器是最严格的筛选器。

该筛选器排除了与基因组其他位点有显著相似度的探针，并且将有无法找到探针的基因组区域。

• 使用“包含区域”并选择“外显子”会限定仅返回那些标记为重叠外显子区域的探针。这在通过基因组或基因注释查找（全文和基因标识符）时有效。设计者应该知道，外显子通常比其他更为GC丰富，这些探针一般来说将有一个较低的探针评分。请参阅常见问题解答“什么是CGH探针评分？”来获取更多信息。使用这种“外显子”方法时，没有可能选择在最近的内含子探针。

• 在eArray之外确认外显子的坐标，并将它们作为基因间隔来选择探针。然后，按照eArray中的“扩展区间边界”，基因片段可以延长超过外显子边界指定数目的碱基对。下面是关于如何确定在UCSC中外显子的坐标。

利用UCSC浏览器的基因表浏览工具，请确保从下拉列表中选择正确的物种和基因组版本。重要的是，版本要匹配eArray。对于“跟踪”，选择所需的基因的定义跟踪，安捷伦建议“CCDS”，“RefSeq Genes”或“UCSC genes”。按照UCSC的指示来限定查找范围。选项包括筛选基因组区域或跟踪标识（名称/登录号）。确保输出含有chrom、exonStarts和exonEnds。这将给出您定义区域的所有外显子的坐标。

若要将这些位置输入到一个eArray高密度(HD)探针查找，按行分段（每个外显子一段），调整起始坐标（the output is 0-based, eArray expects 1-based）。取向（即链信息）不影响eArray的探针查找。例如，下面的行定义了3个外显子（chrom; exon count; exon starts; exon ends）：

chr1; 3，2450045，2451144，2451409，2451048，2451310，

2451544

可转换为eArray所需的格式。：

chr1 :2450046 - 2451048

chr1 :2451145 - 2451310

chr1 :2451410 – 2451544

标准高密度（HD）探针查找可以让您基于染色体位置查找探针，允许您使用过滤器，并允许您在所有片段上设置所需的探针间隔。一个标准高密度（HD）探针查找的结果将是横跨不同片段的均衡探针密度。在高级高密度（HD）探针查找中，针对每个片段都要分别设置筛选器和探针数目。对于每个片段，探针将会被分别选择。即使片段之间有重合。一个先进高级高密度（HD）探针查找需要更多的时间，并且在不同片段，探针密度会有所不同。

一个内置质控探针组是在给定的微阵列设计中一组探针集合。对于每一个安捷伦微阵列设计格式和物种都有一个由eArray建议的默认内置质控探针组。这些内置质控探针组包含针对内生序列的阳性对照探针设计。阳性对照可用于图像取向，并评估样本是否被标记。“基因”内置质控探针组为只包含阴性对照组的常见质控探针组。由于他们缺乏内生阳性对照，它们可以用于任何物种。阴性对照探针组用来衡量元素的背景。以下是几种您会在物种特异性基因内置质控探针组上找到的探针类型。

1. BrightCorner（exp. HsCGHBrightCorner）

a. 用于定向的目的。这些探针被置于微阵列的每个角落，并针对每个角落有不同的模式。

b. 这些探针是为了内含序列而设计的，因此具有物种特异性。缘于在基因组中的多个副本，这些探针预计将有高强度信号。

2. DarkCorner（DarkCorner）

a. 在微阵列的角落中用于取向的目的。这些，加上bright corner探针，构成了角特定的模式。

b. 这些探针与如下所述的3xSLv1探针相同。

3. 阴性内置质控探针组

a. 结构阴性（3xSLv1）

通常高度复制到微阵列，用来衡量元素的背景。这形成了一个发夹探针，并任何物种的标记样品有良好的杂交效果。

b. 生物阴性（例如NC1_00000002）

i. 这些探针是从随机序列中拼凑起来的。他们具有低强度信号，并不与任何样品杂交效果良好。这些探针被用来估计元素的背景。

ii. 目前有82个NC探针。

c. 常见的做法是含有一个高度复制的NC探针（>100），其他的NC探针低度复制（≈6）。

d. 储备阴性（如SM_01）

i. 目前有12个被40倍的复制的序列，其对照类型被标记为“阳性”。它们是储备的阴性对照探针，将来可能会被用作阳性内置质控探针。目前，他们不与任何样品杂交良好。

4. 阳性内置质控探针组

a. 生物阳性（如RnPC_10045851，PC_00000004）

i. 内含“物种特异性”序列，用前两个字母表示，由于在目标基因中发现多个副本，所以预计有高强度信号。这通常作为bright corner探针的同样的探针。

ii. 通常的做法是高度复制这个探针。

b. 删除严格度探针（如DCP_008001.0）

i. 针对内含“物种特异性”序列而设计的探针，用于测量杂交和漂洗严格度。

ii. 大约20个探针，预计在计算机模拟指标下表现良好，被从一个叠瓦式数据库中随机地选择，并一式三份的在微阵列上被印刷。此外，此探针的4个变种版本也被印在微阵列上，通常是一式三份。第一变种有一个碱基对缺失，第二个有3个碱基对缺失，而第三个有5个碱基对缺失，第四变种有7个碱基对缺失。缺失的碱基对是从探针序列中心随机抽取的。缺失的碱基数目用“.”后面的数字指明。例如DCP_008001.0和DCP_008001.3是来自相同的父序列，第一个探针为零缺失，而第二个则有三个缺失。

c. 强度曲线探针（如SRN_800001）

i. 选择大约2000个“物种特异性”探针，预计它们的信号会贯穿实际信号空间。这些信号强度是使用一个内部模型预测出来的。这些探针一般不会被复制。

ii. 这些探针的目的是利用它们进行信号归一化。

对于从安捷伦HD-CGH数据库选择的探针，连接器会自动添加。对于其他探针，例如通过“基因组叠瓦式设计”生成的探针，安捷伦建议添加连接器，来将活跃探针序列推动远离微阵列的表面。这对于短序列来说更重要。

当预计大部分探针将会在异常区域时，归一化或“骨干”探针应被包含进入CGH微阵列，例如在一个非常注重设计的情况下，如果一半探针是在X染色体。但是，在设计整个基因组微阵列时，没有必要将具体的归一化探针包含在其中，因为应该会有足够数量的非异常区域来进行合适的归一化。如果您选择包含归一化探针，探针的归一化最低数量为微阵列的1%（Feature Extraction的要求）,推荐的数量是至少有数百探针，或如果可能的话，微阵列的10％。每个微阵列设计格式都有一个默认的“安捷伦归一化探针组”与之关联，请参见常见问题解答中“什么是安捷伦归一化探针组？”来获取更多信息。

微阵列设计格式都有一个默认的“安捷伦归一化探针组”与之关联。安捷伦归一化探针组尝试偏差远离在DGV（基因变异的数据库）中的探针，但不排除DGV的所有区域。如果您想排除常见癌症的frequent aberration地区，安捷伦建议您创建自己的归一化探针组。请注意，Feature Extraction软件不默认使用的归一化探针组。有关如何使用归一化探针组来在Feature Extraction中进行归一化，请参阅 “查看或更改网格模板属性” 一节，并按照Feature Extraction软件用户指南中，“更改默认DyeNorm基因列表”下，“浏览文件”中的相关指示进行操作。

重复探针用于计算质控指标“重复性”。该指标设置为这些重复探针在异常值删除后，背景提取信号的中位数％CV。“重复性”指标的高分通常表示杂交量过低或烤箱在杂交时停止转动。复制探针的最低数目应>= 300个探针复制5倍。这是因为FE（Feature Extraction）要求Feature Non-Uniformity Outliers（FNUOL）拒绝后最低3倍的复制水平。 默认的“安捷伦复制探针组”的1x244K和1x1M CGH微阵列包含1000个探针并应该加以5倍复制。这1000个探针是从目录微阵列中随机选取的。

不推荐空白，因为Feature Extraction 中的Autogridding将成为一个问题。如果您所选择的设计没有填充满微阵列，以下是安捷伦的建议方案，按优先级排序：

（1）选择一个较小的阵列格式。

（2）复制所有的微阵列探针。

（3）使用安捷伦目录探针组填充微阵列。

此外，如果您的优先选择是提高目标基因片段的探针密度，那么请注意，这将导致探针得分较低（详情请见常见问题“对于特定基因组区域，我需要定位多少CGH探针和/或以什么密度 ？” ）。

目前eArray中还没有能够选择反向互补探针的选项，请联系您当地的安捷伦负责定制微阵列设计的销售服务代表。我们没有数据表明反向互补探针的表现是更好还是更差。

常用的CNV数据库是：

（1）多伦多Hospital for Sick Children的 Database of Genomic Variants (DGV)

（2）CHOP (Children's Hospital of Philadelphia) 和宾夕法尼亚大学的Copy Number Variation

（3）Wellcome Trust Sanger Institute的DECIPHER （Database of Chromosomal Imbalance and Phenotype in Humans using Ensembl Resources）

您可以通过从eArray下载.bed文件，来加载您想要的区域到UCSC基因浏览器。

在eArray的主页点击“快速开始指南”，在那里您会发现一个PowerPoint格式的详细教程。

理想状况下，eArray探针设计算法会为输入的每个目标序列选择不同的探针。然而，算法也会在没有其他特异探针可用时提供一个“共享”探针。通常如果目标序列集中的两个或多个序列总体上非常相近，或者在探针选择（偏置3'端）区域的转录谱类似/相同，这种情况就会发生。

当您使用GE探针设计工具来创建探针是，eArray会保存探针到您下载、排序、并分析的文件中。然而，您必须在eArray将探针发送给数据库之前，将探针保存为探针组，并让它们查找可见。

eArray会在设计探针之前，将相同或高度相似的序列汇集成簇。请参阅GE探针设计怎样处理高度相似的序列。

eArray针对您目标序列集合中的具体转录谱的探针设计的能力取决于您所选择的转录组的特征。如果ESTs或者预测基因构成了您的目标转录组中的主要转录谱，那么也会出现相累似的结果。换句话说，您应该选择那些能够最好表征您的DNA样品的参考序列。